Josefine Preuß wurde 1986 im brandenburgischen Zehdenick geboren und wuchs mit einer älteren Schwester in Potsdam auf. Ihre Eltern, die Mutter Lehrerin, der Vater bei der Polizei, unterstützten sie, wo sie konnten. Schon in ihrer Kindheit sammelte sie in Theatergruppen erste Schauspielerfahrungen, nahm Geigenunterricht und war auch als Sportlerin in Rhythmischer Sportgymnastik und Akrobatik aktiv.
Bereits mit 14 Jahren erhielt sie im Jahr 2000 ihre erste größere Rolle in der Kinder- und Jugendserie „Schloss Einstein“, in der sie drei Jahre lang die zickige Anna Reichenbach verkörperte. Es folgten weitere Rollen in den Teenie-Filmen „Klassenfahrt – geknutscht wird immer“ aus dem Jahr 2004 sowie ein Jahr später in „Schüleraustausch – die Französinnen kommen“. Noch im gleichen Jahr starteten die Dreharbeiten für die Vorabendserie „Türkisch für Anfänger“, die Josefine Preuß nicht nur einem größeren Publikum bekannt machte.
Für ihre Rolle als Lena war sie im Jahr 2006 beim „Festival de Télévision de Monte-Carlo“ als „beste Darstellerin in einer Comedy-Serie“ nominiert, ebenso im Jahr 2007 für den „Deutschen Comedypreis“. Im Jahr 2011 folgte eine Kinoadaption der beliebten Vorabendserie, in der Preuß erneut in die Rolle der Lena schlüpfte.
Mit den Jahren wuchs Josefine Preuß aus den Jugendrollen heraus. Dass sie auch in anderen Genres mitspielen kann, stellte sie beeindruckend in den Fernsehmehrteilern „Das Adlon“ im Jahr 2013, „Die Pilgerin“ 2014 sowie „Das Sacher“ im Jahr 2016 unter Beweis. Für ihre Darstellung in „Die Hebamme“ erhielt sie 2014 den Bambi als beste Hauptdarstellerin. Seit 2010 ist sie zudem in verschiedenen Filmen der Serie „Lotta“ in der Hauptrolle zu sehen.